Mohon untuk tidak mengupload file materi perkuliahan yang berbentuk pdf, ppt, doc, xls ke Blog Staff UMY -- Silahkan upload file-file tersebut ke E-Learning NFk-B(nuclear Faktor kappa B) Pertemuan ke IV – Andy eko wibowo

NFk-B(nuclear Faktor kappa B) Pertemuan ke IV

    Dimerik protein yang terebusun atas 2 komplek sub unit protein , ukurannya p 50 kdalton dan ukuran p65.membentuk komplek dan mengenali sekuen spesifik. NfkB ini komplek dimerik, asalnya dari luar, dia bisa masuk…dari mana dia bisa masuk, sebelumnya, asalnya dari sini, nfk B asalnya dari kompelk p105 dan -65, nah..protein =protein ini kemudian di phosoporasilasi oleh suatu signal yaitu Lkk dan juga diaktifasi oleh jalur jalur lain, dan yang p105 dikenali esuatu enzim, yang kemudian ditempeli polipeptida kecil ubikitin, protein yagn ditempeli oleh ubikitin, merupakan suatu protein ciri kahas yang dikenali oelh suatu protein kinase, yaitu adalah enzim yang tugasnya mendegradasi protein lain. Protein yang dikenali oleh protein ini, dinamakan protein besar, namanya gloteasom, di potong menjadi P50. ketika masih di sitosol (di luar inti), di a akan di ikat oleh protein lain ikbalfa, (jadi ada protein p50, p65, dan iKb alfa. Selama protein ini diikat oleh ikb alfa, maka protein tidka bisa masuk ke dalam inti sel, sehingga tidak bisa melakukan fungsinya sebagai faktor trnskripsi.

    Bagaimana ini bisa masuk kesini?

    Klo ikb alfa itu lepas, protein komplek bisa masuk. Bagaimana ikb alfa bisa lepas? Diawali proses fosfolirasasi IKB-alfa, biasanya di residu serin , threonin, tyrosin. Sdi phosporilasi, maka di kenali oleh enzim ubikiniase , dan ditempel oleh ubikitin. Etiaka ikbalfa sudah ditempelei ubikitin, maka dia dikenali oleh protein proteasom, di hancurkan. Karena udah hancur, maka komplek bebas, sehingga bisa masuk ke dalam intraseluler.

    Siapa yang memposporiasli IKBalfa..yatitu protein kinase yaitu inhibitor kapabi kinase (IKK). Siapa yang mengaktifasi IKK.? Lewat NIK dan MEKK1. bisa di aktifasi jalur jalur upstreamnya, bisa lewat traf6, Tnf alfa resepotor, .dall yang semuanya ni bisa diaktifasi melalui molekul signaling bisa senyaw akecil, atau polipeptida.

    NF-kB and AP 1 connection : mechanism of NF-kB-dependetn regulation of AP-1 activiry

    Fos, membentuk kompek, yan gbertmotif leusin zipper

    clip_image001

    Bagaimana orang melakukan penelitian membuktikan NFKB dan AP yang keduanya merupakan faktor transkripsi ada hubungan!.

    1. Di blok , membuat model sel yang cirinya NFKBnya di hambat, untuk itu dia menggunakan sel MDAP anc-28, yang bisa mengekspresi NFKB, dan menggunakan sel MDAPacc-28 yang tidak mengekspresikan dua alfa. Selnya sama, yang satu di buat mengekspresi tinggi IKB alfa, kita tahu tadi IKB alfa tadi fungsinya apa?>inhibitor NF-KB. Dengan cara mengeninfeksi IKBalfa M, pada selnya itu. Jadi di translasikan yang bisa mengekspresikan gen secara konstitutif, di masukkan kedalam sel sehingga sel itu akan mengekspresikan IKB alfa. Peneltiian ini sudah sangat umum, apakah model ini bisa memberikan pengaruh apa yang ingin kita amati.

    Jadi yang di western blood itu ekstra protein sitoplasmanya, yang diamati bukan inti? Karena dia ada di luar inti, di amengekstraksi citoplasmanya. Selanjutnya, ekstrak protein intinya, juga di amati, di lakukan ekspreriamen menggunakan EMSA (elektro poretik mobility save assay), ada pengamatan pergeseran dengan cara elektroforesis, untuk mengamati NF-KB, AP-1, dan Oct 1 probe as a control. Ekspresiion of C-fos in MDAP nc 28/panc-28 /iKBalfa cell

    Ini menggunakan tiga teknik western blod, emsa, dan norten blod..

    Pertanyaannya mengapa menggunakan ketiga itu? Toh ini melihat kejadian sesuatu.?

    Ini menggunakan western blod, betaaktifin sebagai kontrol posisitifnya, disertai degan kontrolnya, supaya menjamin validitas data yagn dihaslkan. Dikontrol dengan beta aktiin, untuk melihak IKB alfa, pertama kali, sel itu di transeksi dengan gen IKB alfa. Betul tidak di trranskripsikan IKB alfa, dengan cara memaksa mengeksresikan IKB alfa. Karena IKB alfa meregulasi NFKB sehingga NFKB menjadi tidak aktif didalam inti sel, sehingga ini menjadi sangat penting, sehingga di butkikan sel itu mengekspresikan NFKB alfa. Mengapa yagn dilihat protein? Karena yagn berperan adalah protein, yang melakukan fungsi aktifnya adalah proteinnya dengan western blot (untuk melihat protein).

    Ttadi ingin melihat apa namanya, apakah nFKB itu aktif atau tidak? Oleh karena itu maka dilakukan ekstraksi protein inti sel, karena NFKB yang aktif itu ada di intisel, klo kita lihat tadi disini,NFKB dan AP1menjadi fokus pengamatan , seangkan harus ada kontrolnya Oct-1 , sebagai faktor transkripsi, ini tidak berpengaruh terhadap IKB alfa. Kira – kira kesimpulannya apa? Sel yagn ditransfeksi retrovirus yang mengandung IKB alfa tadi, betul betul mengekspresikan IKB alfa, artinya memang sel itu mengeksresikan IKB alfa. Apa ampaknya terhadap aktfiasi NFKB, dan IP 1? Harapannya NFKB tidak bisa masuk, dan ap1 tidak bisa masuk..

    Yang pertnama NFKB (p50, probenya pakai p50). EMSA

    Merupakan short regulatori elemen dari suatu faktor tragetn faktor transkirpsi kita, yang itu di label dengan isotop phospate, dia menggunakan untuk wildi itpe KPB, untuk mutan, menggunakan sekuen ini, wildtiype AP1 jugaada.., dan ELK 1. caranya ekstrak protein dari inti tadi di inkubasikan dengan DNA. Maka yang terjadi nempel. Klo faktor transkripsinya ada, disitu ada sekuen spesifik, dia akan berikatan kemudian di elektroforesis, DNA yang berikatan degnan tidak berikatan, lajunya berbeda, nah kemudian di deteksi dengan centileter counter, kemudian diamati, ini ada yang menempel. Oh ini tidak ada menemple. Yagn menempel banyak. Inilah yang disebut EMSA.

    clip_image002

    Maka muncullah data seperti ini, klo banyak protein yang menempel disitu, terlihat signal tebal. Klo tipis, sedikit protein yang ada disitu, artinya, tidak teraktifasi. Disini bisa kit a lihat, yang puro tidak di transfeksi dengan IKB alfa, disini di lihat tbeal, di iKBalfa, tipis. Artinya yang ditransfiksi terhambat, jadi ICBalfa menginhibitor, kemudian yang AP1, banyak yang aktit ko di puro, tapi klo di IKBalfa banyak yang terhambat. Berarti IKBalfa itu tadi mempnegaruhi AP1. data ini valid g? di kontrol dengan Oct-1, oh betul , soale Oct 1 tetap terekspresi kok!

    p;ertanyaannyanya, AP1 itu protein yang mana? Apa benar C-fosnya itu turun? Apakah karena C-fosnya turun? Protein yang di ekspresi AP1? Pengamatan ekspresi ini tidak lewat protein nya, tapi lewat mRNAnya, dengan metode norten blood, mengamati mRNA. (ujian keluar). Dia menggunakan prosedur standar, di ekstraksi mrna nya dari sel, diamati berapa tinggi level ekspresi dari Cfosnya, dengan pelacak probe radio isotop. Diamati spesifik untuk C-fos. Hasilnya C-fosnya rendah di banding dengan kontrol. Artinya NFKB itu menyebabkan level ekspresi C-fos turun. Diamati melalui mRNA, karena ini memang melihatpengaruh langsung NFKB dari C-fosnya itu. NFKB sebagai faktor transkripsi,. Klo di amentranslate, yang diamati MRNA. Berarti mRNA nya sedikit. Sementara pada sel kontrol, jauh lebih tinggi. Benar g dta ini? Maka di kaontrol dengan GAPDH.(gliseral dehid 3 phosphat di hidrogenase), kelas enzim yang mengkatalisis reaksi

    Suatu pengamatama yang menggunakan model reporter gen, apa yagn diamati? Adanya aktifasi NFKBS dan AP1. kita cari mdoel agar sel bisa melapor ke kita? Modelnya adalah ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,yang dilaporkan adalah NFKB dan AP1 akctivation. Menggunakan 2 tyoe, yaitu wildh tipe MDAPAnc 28/purop dan MDA Psn 28/IKBalfa M. Bagaimana ktia tahu NFKB itu aktif atau tidak aktif. Ini kan faktor transkripsi, pertanyaannya aktif atau tidak? Kita pakai model analysis assay, luciferase rporter gen assay. Luciferase adalh protein yang bisa berfluoroscenci. Dari gen luciferase, ditaruh upstream dari short regulatory element dari yang kita hendaki, sehingga misal RE dari NFKB, maka klo ada NFKB yang aktif, maka protein akan terkekspresi, muncul fluoroscenci. Ditangkap signal itu, di kuantifikasi, dan di rekord, di bikin grafik B. untuk membuktikan ada didalam inti g, bener g aktif atau tidak aktif. Kita lihat disini, ini pakai satuan relatif y. relatif aktifitif

    Yang paling kiri adalh puro mutant, sekuen dirubah sedikit, bisa nempel G? G bisa,. Trus yang Puro Wild tipe, dan ditranfeksi dengan ICBalfa M. yang NFKB, yang mutan tidak ada ekspresinya…tidak ada perbendaran, artinya, tidak ada ekspresi. Kemudian yang puro, ada ekspresi luciferase, artinya NFKB aktif atau AP 1 disitu terkespresi. Kemudian yang Ibalfa M, ekspresi rendah. Ini mutant sebagai kontrol.,sengaja di bikin g terekspresi.yang tengah tinggi sekali, karena tidak ada inhibitor, kemudian rendah karena ada inhibitornya. Benar – benar menghambat aktfitas AP1.

    Di bantu mikirin yang C apa ? D apa? Cara mbacanya gimana?

    clip_image003

    Wt kB oligos , mutant di deteksi dengan Rle A/p50,

    Ini untuk melihat jenis jenis IKB yagn terlibat di sini, klo kita lihat, maka disini memperlihatkan alfa dan rel a 50 sama asama aktif di dalam sel itu. Karena ini menggunakan deteksi Rel A dan Rel aP50, klo kita lihat di sini, kemudian di kroskan dengan hasilnya yang AP1, ternyat sama, jadi memberikan aktifitas data di Rel A 50 dan di C fos itu memberikan data yagn sama, artinya ada hubunganya antara rel A 50 dan C fos. Paaki EMSA lagi. FP itu adalah sekuen dnayang tiak terikata protein, lajunya cepat sekali.

    Ujiannya mengambil salah satu gambar di papper ini.

Be the first to comment

Leave a Reply

Alamat email Anda tidak akan dipublikasikan.


*